2019年2月28日，Science（《科學》）發表了一篇名為“Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos”（《單堿基編輯會導致難以預測的脫靶性單核苷酸突變》）的研究論文，該研究由中國科學院神經科學研究所（簡稱神經所）、中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心和中國科學院上海營養與健康研究所隸屬的計算生物學研究所（中國科學院-馬普學會計算生物學伙伴研究所，簡稱計算生物學所）、斯坦福大學遺傳學系以及中國農業科學院深圳農業基因組研究所合作完成。該研究建立了一種被命名為GOTI的新型脫靶檢測技術，并使用該技術發現新興的單堿基編輯技術有可能導致無法預測的脫靶，因而存在風險。此研究顯著提高基因編輯技術的脫靶檢測敏感性，并且不借助于任何脫靶位點預測技術，可以發現之前的脫靶檢測手段無法發現的完全隨機的脫靶位點，為基因編輯工具的安全性評估帶來了突破性的新工具，有望成為新的行業檢測標準。
作為新一代基因編輯工具，CRISPR/Cas9自從2012年被發明以來，一直以其高效性和特異性備受世人的期待和廣泛關注，學術界普遍認為基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的臨床技術將為人類的健康做出巨大貢獻。然而值得注意的是，CRISPR/Cas9從問世以來，其脫靶風險也一直備受關注，如果將CRISPR/Cas9及其衍生工具用于臨床的話，脫靶效應可能會引起包括癌癥在內的很多種副作用，因此一種能夠突破之前限制的脫靶檢測技術，將會成為CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最終走上臨床的關鍵。
在此之前，人們推出過多種檢測脫靶的方案，然而之前的技術大多都依賴于未必十分準確的脫靶位點預測，并且會引入大量噪音的體外擴增，這導致人們一方面難以顧及預測位點以外的脫靶情況，另一方面又很難將脫靶信號從背景噪音中分離出來，因此關于CRISPR/Cas9及其衍生工具的真實脫靶率一直存在爭議。人們希望可以找到一種既能夠不依賴于脫靶位點預測，又能有足夠信噪比的精密脫靶檢測手段。
為了實現這一目標，李亦學研究組與合作者建立了一種名叫GOTI的脫靶檢測技術。在小鼠受精卵分裂到二細胞期的時候，編輯一個卵裂球，并使用紅色熒光蛋白標記。在小鼠胚胎發育到14.5天時，將整個小鼠胚胎消化成為單細胞，利用流式細胞分選技術基于紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細胞和沒有基因編輯細胞，全基因組測序比較兩組差異。這樣就避免了單細胞體外擴增帶來的噪音問題。由于實驗組和對照組來自同一只小鼠，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細胞的基因組，其中的差異基本就可以認為是基因編輯工具造成的。
在與合作單位的共同努力下，GOTI系統被成功建立了起來。借助于這個系統，團隊成員先是檢測了最經典的CRISPR/Cas9系統，結果發現，設計良好的CRISPR/Cas9并沒有明顯的脫靶效應，這個結果結束了之前對于CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。然而團隊還檢測了另一個同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術BE3，這個系統可以精確引入點突變，在之前的研究中從未發現過有明顯的脫靶問題。然而在GOTI的檢測下發現，BE3存在非常嚴重的脫靶，這些脫靶由于大多出現在傳統脫靶預測認為不太可能出現脫靶的位點，之前一直沒有發現其脫靶的嚴重問題。團隊分析后認為，這些脫靶位點有部分出現在抑癌基因上，因此經典版本的BE3有著很大的隱患，不適合作為臨床技術。
在基于GOTI技術的脫靶檢測中，團隊發現以BE3為代表的部分基因編輯技術存在無法預測的脫靶風險，讓世人重新審視了這些新興技術的風險。更重要的是，此工作建立了一種在精度、廣度和準確性上遠遠超越之前的基因編輯脫靶檢測技術，達到了目前理論和技術水平所能達到的最高程度，有望由此建立新的行業標準。
該項工作主要由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心/神經科學研究所博士后左二偉、中國科學院分子細胞科學卓越創新中心/生化與細胞所博士研究生孫怡迪、計算生物學所研究員魏武、中國農業科學院深圳農業基因組研究所助理研究員袁堂龍等在神經所楊輝研究員、計算生物學所李亦學研究員、斯坦福大學Lars M. Steinmetz教授的指導下完成，并得到了神經所流式分選平臺的的大力協助，是眾多研究組通力合作的重要成果。本工作得到國家高科技研發項目（2018YFC2000100與2017YFC1001302 to Yang Hui, 2017YFC0908405 to WW），中科院戰略性先導科技專項（XDB32060000），國家自然科學基金委員會（31871502, 31522037），上海市科技重大項目（2018SHZDZX05），上海市科學技術委員會項目（18411953700, 18JC1410100），美國國立衛生研究院P01項目（P01HG00020527）等項目的資助。
原文鏈接：https://doi.org/10.1126/science.aav9973
(A)實驗流程?(B)脫靶位點數目比較。Cre-, Cas9-, BE3- and ABE7.10組分別有14+/-12 (SEM, n=2),?12+/-4 (SEM, n=11),?283+/-32 (SEM, n=6)和10 +/- 5 (SEM, n = 4)個SNVs?(C)突變類型的分布比較。每個格子中的數字表示該種突變類型占全部突變的比例 (D)脫靶SNVs富集在基因組中的轉錄區域?(E)Genes包含脫靶位點的基因在細胞胚胎中有更高的表達量。
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